TOPO-клонирование

• Доля целевых клонов – 95%;
• Время реакции – 5 минут при комнатной температуре;
• Все необходимые реагенты включены в набор;
• Проверенная методика: более 4 000 цитирований;
• Возможность выбора наиболее подходящих компетентных клеток;
• Простой протокол.

Принцип клонирования TOPO®

Топоизомераза I

Основа метода – реакция в присутствии топоизомеразы I, выполняющей роль одновременно эндонуклеазы рестрикции и лигазы. Биологическая роль этого фермента – релаксация сверхскрученной кольцевой молекулы ДНК во время репликации путём её разрезания и последующего сшивания. Топоизомераза I вируса коровьей оспы специфически распознаёт последовательность (C/T)CCTT и образует ковалентную связь с 3´-тимидином, внося одноцепочечный разрыв в ДНК. Разрыв обеспечивает свободное вращение одной цепи ДНК относительно другой и релаксацию спирали. После этого топоизомераза I сшивает концы разрезанной цепи обратно, разрывая связь с 3´-тимидином, и высвобождается.

Векторы TOPO®

Векторы TOPO® поставляются в линеаризованном виде с пришитой к каждому 3´-фосфату топоизомеразой I для использования её лигазной активности. Это позволяет быстро (всего за 5 минут) сшить вектор с совместимыми концами клонируемого фрагмента ДНК (вставки).

Механизмы клонирования

• TOPO® TA – комплементарное спаривание 3´-T вектора и 3´-A продукта ПЦР с ДНК-полимеразой Taq с последующим лигированием;
• Клонирование по тупым концам Zero Blunt® TOPO® – сшивание вектора с продуктом ПЦР по тупым концам, приводящее к разрыву летального гена ccdB;
• Направленное клонирование Directional TOPO® – встраивание фрагмента ДНК в вектор в нужной ориентации. Вектор имеет один выступающий 5´-конец (GGTG), а один из концов вставки достраивают комплементарной последовательностью (CACC).

Компетентные клетки, входящие в состав наборов TOPO®

Наборы TOPO® производятся в нескольких модификациях, различающихся включёнными в состав компетентными клетками. С 2012 года выпускаются также наборы без компетентных клеток.

Основные марки компетентных клеток

• One Shot® – удобный формат фасовки клеток: одна пробирка – одна трансформация;
• MAX Efficiency® – марка клеток с высокой эффективностью трансформации (108–109 КОЕ/мкг и более). Такие клетки пригодны для клонирования малых количеств ДНК и ПЦР-клонирования;
• T1R – клетки, устойчивые к фагам T1 и T5.

Компетентные клетки E. coli для клонирования

Все перечисленные штаммы имеют эффективность трансформации не менее 109 КОЕ/мкг.

• Химически компетентные клетки:
• One Shot® MAX Efficiency® DH5α™-T1R – клетки-производные штамма DH5α™. Как и исходный штамм, эти клетки поддерживают трансформацию неметилированной ДНК (продукты ПЦР) и бело-голубую селекцию, а также сниженный уровень неспецифического гидролиза и рекомбинации ДНК. Эффективность трансформации – не менее 109 КОЕ/мкг;
• One Shot® Mach1™-T1R – в дополнение ко всем упомянутым достоинствам DH5α™-T1R являются самым быстрорастущим штаммом компетентных клеток: время удвоения всего 50 мин (в 1,5 раза короче, чем у большинства штаммов, используемых в клонировании). Это позволяет перейти от ночной колонии к выделению плазмиды всего за 4 часа. Наборы TOPO® с клетками Mach1™ позволяют сэкономить до 2 дней по сравнению с традиционным методом на основе эндонуклеаз рестрикции;
• One Shot® TOP10 — поддерживают эффективную трансформацию как неметилированной, так и метилированной ДНК (фрагменты геномной ДНК). По генотипу близки к штамму DH10B™;
• One Shot® TOP10F´ – TOP10 с F´-эписомой для продукции одноцепочечной ДНК.
• Электрокомпетентные клетки:
• One Shot® TOP10 Electrocomp™ – TOP10, трансформирующиеся электропорацией.